Proiectul Open Antibodies este o colaborare globală de cercetare promovată în comun de UC Davis, NIH NeuroMab Facility, DSHB și Addgene. Acesta își propune să abordeze criza de reproductibilitate a anticorpilor prin standardizare, transparență și partajare deschisă. Implementarea sa nu este o inițiativă liberă, ci un proces de inginerie în șase-pași care este executabil, auditabil și reproductibil.
1. Achiziția standardizată și transmiterea secvențelor genelor de anticorpi
Sursa: celulele B specifice-antigenului sunt izolate de la animale imunizate sau de la pacienți recuperați folosind tehnologia de sortare a celulelor B unice (cum ar fi FACS). ARNm BCR este extras și amplificat prin RT-PCR pentru a obține secvențele V(D)J complete ale lanțurilor grele și ușoare.
Cerințe de format: secvența trebuie să fie în format FASTA și să includă adnotări pentru fragmentele genelor V, D și J.
Trebuie incluse informații despre imunogen (numele antigenului, specie, procedura de imunizare).
Trebuie indicată originea clonării (de exemplu, „donator uman #27, post-infecție cu SARS-CoV-2”).
Platforma de trimitere: Trimiteți date brute de secvență prin formularul Addgene „Sugerați o plasmidă”.
Puncte cheie: secvența trebuie să fie o genă a anticorpului recombinant; este interzisă prezentarea anticorpilor nesecvenționați derivați din hibridoame.
2. Construcția plasmidei și ansamblu vectorial de expresie proiectat
Selecția vectorului: Se utilizează vectori de expresie standard de mamifere (de exemplu, pCMV sau pEF1), asigurând includerea regiunii constante Fc IgG1 și secvența Kozak.
Metoda de clonare: Utilizați asamblarea Gibson sau clonarea Golden Gate pentru a obține o împerechere naturală a lanțurilor grele și ușoare, evitând combinațiile aleatorii.
Convenții de denumire a plasmidelor:
OpenAb_[Antigen]_[Specie]_[CloneID]_v1
Exemplu: OpenAb_SARS2_Spike_hu_047_v1
3. Trimitere și revizuire prin intermediul platformei Addgene
Intrare de trimitere: Accesați formularul Addgene Suggest a Plasmid
Criterii de revizuire: Secvență fără contaminare și mutații frameshift; Plasmida conține promotor și terminator complet; Furnizați o hartă plasmidă (fișier .gb)
Timp de examinare: de obicei, 7–14 zile lucrătoare. După aprobare, un ID Addgene (de exemplu, #123456) este atribuit și plasmida este adăugată public la baza de date.
Rezultat: Plasmida devine o resursă care poate fi căutată la nivel global, disponibilă gratuit oricărui cercetător.
4. Generarea și încărcarea standardizate a datelor de validare
Metode de validare: Trebuie să respecte cei cinci piloni ai IWGAV (Grupul Internațional de Lucru pentru Validarea Anticorpilor):
|
Tip de validare |
Metodă |
Cerințe |
|
Validare genetică |
Knockout/knockout CRISPR a proteinei țintă |
Dispariția sau reducerea semnificativă a benzilor WB |
|
Validare ortogonală |
Comparație cu rezultatele spectrometriei de masă sau ARN-seq |
Model de expresie consistent |
|
Validarea independentă a anticorpilor |
Validare{0}}încrucișată folosind anticorpi cu epitopi diferiți |
Rezultate consistente |
|
Validare funcțională |
Test de neutralizare, citometrie în flux |
Demonstrează funcția biologică așteptată |
|
Validarea aplicației |
IHC, IF, WB, FC |
Colorare specifica aplicatiei tinta |
Format de date:
Imagini IHC/IF: trebuie să includă control negativ (țesut knockout) și control pozitiv.
Imagini WB: trebuie să includă markeri de greutate moleculară și controale interne (de exemplu, -actina).
Toate imaginile trebuie să fie încărcate în format TIFF fără pierderi, împreună cu parametrii experimentali (raportul de diluție a anticorpilor, timpul de expunere).
Cerință obligatorie: Toate datele de validare trebuie publicate împreună cu plasmidele; nici unul nu este de nelipsit.
5. Distribuție și utilizare gratuită la nivel global
Metoda de acces:
Vizitați Addgene Antibody Plasmid Collection
Căutați anticorpul țintă (de exemplu, „OpenAb_SARS2_Spike”)
Trimiteți un Acord de utilizare non-comercială (nu este necesară nicio plată)
Primiți plasmidă (de obicei 5-10 zile lucrătoare)
Instrucțiuni de utilizare:
ID-ul Addgene și sursa originală a secvenței trebuie să fie citate în lucrare.
Încurajați trimiterea de date noi de validare înapoi către Addgene pentru a forma un ecosistem-în buclă închisă.
6. Feedback continuu și iterare a ecosistemului
Mecanism de feedback de date: utilizatorii încarcă noi rezultate experimentale (de exemplu, noi aplicații, noi reactivitate a speciilor) pe platforma Addgene, formând o bază de date dinamică de validare.
Guvernarea comunității: DSHB și NIH publică în mod regulat rapoarte de calitate a anticorpilor, eliminând anticorpii ineficienți sau -reactivi încrucișați.
Rezultate: din 2025, 89% din cercetările care utilizează anticorpi cu sursă deschisă-poate fi reproduse în mod independent, depășind cu mult 45% pentru anticorpii comerciali.
